ANIMALI TRANSGENICI

Da alcuni anni sono state messe a punto delle tecniche che consentono di inserire sequenze di DNA in embrioni animali ad uno stadio iniziale dello sviluppo. Il DNA esogeno, una volta integrato nei cromosomi delle cellule embrionali, resta stabilmente incorporato in tutte le cellule dell'individuo e si comporta come qualsiasi altro gene presente nel genoma. L'animale che reca il gene estraneo viene indicato come transgenico e il gene stesso è denominato transgene. La tecnica più utilizzata per la produzione di animali transgenici è la microiniezione di geni clonati in uova fecondate. Nel corso della fecondazione uno spermatozoo si fonde con la cellula uovo: in questo modo nella cellula uovo fecondata vengono a trovarsi due nuclei (chiamati pronuclei), uno derivato dallo spermatozoo e uno dall'uovo. I due pronuclei ad un certo punto si fondono e formano il nucleo dell'embrione allo stadio di una cellula (lo zigote). Per effettuare la microiniezione, si devono prima di tutto raccogliere le uova fecondate; il DNA estraneo viene, quindi, microiniettato in uno dei due pronuclei degli embrioni che, dopo aver subito l'iniezione, vengono trasferiti nell'ovidotto di una madre adottiva. Per effettuare questa manipolazione è di fondamentale importanza la scelta del momento in cui si esegue la microiniezione; infatti se si inietta il DNA esogeno quando lo zigote ha già iniziato a dividersi gli animali ottenuti avranno il gene esogeno solo in alcune parti del corpo: si tratta di animali mosaico. Il DNA introdotto generalmente si inserisce nei cromosomi dell'embrione, ma la percentuale di uova che sopravvive alla manipolazione e si sviluppa fino al termine è molto bassa (nelle vacche, ad esempio, solo una su mille dà origine ad un vitello). Dopo la nascita gli animali devono perciò essere saggiati per verificare la presenza del DNA estraneo: a questo fine si deve prelevare una porzione di tessuto che viene analizzato mediante tecniche quali il Southern blotting (l'ibridazione viene effettuata con una sonda che corrisponde al gene inserito) oppure la PCR (reazione a catena della polimerasi per amplificare il DNA estraneo). Esistono altre tecniche per ottenere animali transgenici, come l'infezione dei precursori di ovociti con retrovirus transgenici recanti il gene estraneo. Questi metodi sono però meno efficaci e richiedono l'utilizzo di virus patogeni, con notevoli rischi per quanto riguarda la facilità con cui avvengono delle ricombinazioni a carico del genoma virale, il quale può riacquistare la capacità d'infettare e quindi distruggere la cellula ospite; per questi motivi la tecnica della microiniezione resta la più sicura ed utilizzata.

Le nuove tecnologie hanno reso possibile un miglioramento delle attività produttive basate su organismi e processi biologici con numerose applicazioni in campo zootecnico: nel 1987 si stima siano nati 250.000 vitelli grazie al trasferimento di embrioni manipolati, i quali possono essere congelati e conservati all'infinito nell'azoto liquido. Numerose possono essere le applicazioni dell'ingegneria genetica impiegando animali transgenici; infatti si è riusciti a produrre medicinali, di cui la maggior parte sono proteine, dai mammiferi aggirando i rischi e le operazioni necessarie se prodotte artificialmente. Queste modifiche sono normalmente realizzate nei liquidi corporei dei mammiferi, pertanto si è pensato di fare produrre ai suddetti animali direttamente le proteine nel sangue o nel latte. Ciò è avvenuto attraverso la sostituzione dei promotori dei geni che si desidera trasferire con i promotori dei geni di proteine del latte come la alfa-caseina o la beta- lattoglobulina; esse infatti si attivano solo nel tessuto della ghiandola mammaria e in tal modo il gene sostituito risponderà ai segnali presenti in questo tessuto producendo la proteina esogena (e solo a questo livello). Questa tecnica è stata utilizzata nel 1987 con la creazione di un topo transgenico contenente diverse copie del gene che codifica l'attivatore del plasminogeno umano (proteina in grado di sciogliere i trombi, causa di occlusioni coronariche) e ne è risultato un latte di topo con 300 nanogrammi di attivatore per litro. Questo esperimento fu ripetuto poi con le capre per avere una più alta quantità di attivatore. Un altro esempio interessante è la produzione del fattore antiemofilico umano IX, in quanto la mancanza di questa proteina causa l'emofilia B. Un gruppo di biotecnologi di Edimburgo ha prodotto una pecora transgenica recante il fattore antiemofilico sotto il controllo del promotore della beta-lattoglobulina con la produzione di un latte contenente 5 microgrammi della proteina per litro ; inoltre ha progettato una pecora transgenica che sotto il controllo dello stesso promotore reca il gene per l'alfa1-antitripsina, una proteina utilizzata per la cura dell'enfisema, con la produzione di 2 grammi della proteina per litro di latte. Un altro bioreattore animale è il coniglio, interessante sia dal punto di vista della produzione di proteine, sia per la loro grande capacità di riproduzione, anche se la più promettente resta comunque la vacca con 35 grammi di proteine per litro; la vacca è stata infatti utilizzata per la produzione di un latte a basso contenuto batterico indicato per le persone immunodepresse, mettendo sotto il controllo del promotore del gene della alfa-S1-caseina alcune copie del gene per la lattoferrina umana, in grado di inibire lo sviluppo di alcuni batteri.

Gli animali transgenici sono anche utili modelli sperimentali per la ricerca; grazie ad essi è già possibile produrre una serie di proteine a basso costo utili per la farmaceutica veterinaria, ad esempio ormoni, immunomodulatori, anticorpi monoclonali prodotti con tecniche di fusione cellulare, antigeni di virus o di altri microrganismi patogeni. Per l'identificazione di alcuni agenti patogeni si possono utilizzare tecniche di ibridazione con sonde di DNA o RNA marcate con diversi sistemi; tecniche analoghe permettono inoltre di identificare quelle mutazioni che fanno comparire e scomparire delle particolari sequenze di DNA che vengono riconosciute e tagliate da enzimi di restrizione, generando frammenti di DNA con lunghezze diverse detti RFLP. Essi possono essere associati a geni che conferiscono particolari caratteristiche che si desidera eliminare o diffondere nelle popolazioni; un esempio applicativo di questa tecnica riguarda una ricerca condotta sugli RFLP del gene della k-caseina, una delle principali proteine del latte, che presenta due varianti, A e B, di cui la seconda ha un più alto contenuto in proteine e caratteristiche migliori sia per la caseificazione sia per la produzione di latte in polvere. Dato che il gene per la variabile B è più raro nella frisona, che è la razza più usata per la produzione di latte, sarebbe utile selezionarlo per ottenere animali produttori di latte con la k-caseina B. Per attuare rapidamente questa selezione è necessario conoscere quali varianti geniche sono presenti nei riproduttori; nelle femmine tali informazioni si ricavano facilmente con l'analisi delle proteine del latte, che ovviamente non può essere applicata ai tori, per i quali l'impiego degli RFLP permette di ottenere in pochi giorni le informazioni necessarie, evitando di dover valutare la loro progenie femminile, con inutile perdita di tempo. La selezione assistita da marcatori, identificati grazie a sonde di DNA, permette quindi di ottenere, con pochi incroci, animali con le caratteristiche desiderate. E' importante inoltre la possibilità di identificare RFLP associati a qualsiasi caratteristica ereditaria tramite sonde appropriate; inoltre attraverso lo studio dei gruppi famigliari si possono determinare le frequenze di ricombinazione tra due marcatori in modo da costruire una specie di mappa genetica; l'identificazione e la mappatura di marcatori è inoltre facilitata dal fatto che spesso esiste una notevole conservazione dell'ordine e dell'associazione dei geni in diverse specie, come nel caso dell'uomo, del topo e del bovino.

La regolazione della crescita di ogni animale è un processo complesso, in cui intervengono il patrimonio genetico, l'alimentazione e un complicato circuito ormonale; nei vertebrati un ormone chiave si produce nella ghiandola pituitaria ed è chiamato ormone della crescita. Alcuni scienziati dell' Università di Pennsylvania hanno progettato dei maiali transgenici recanti copie molteplici del gene bovino per l'ormone della crescita. Questi maiali aumentano di peso più velocemente dei loro simili e la loro carne è migliore sul piano nutritivo, contenendo meno grassi è indicata nelle diete ipocaloriche. Purtroppo però questi esemplari presentano gravi anomalie fisiche, infatti alla nascita sono più piccoli dei loro fratelli, in più mostrano scarso appetito e una tendenza alla letargia, inoltre da adulti soffrono di artrite, infertilità e sono soggetti all'ulcera; tutto ciò è dovuto all'eccesso di ormone nel sangue. Diversa è la situazione per quanto riguarda i pesci, i quali non hanno nessun problema legato alla sovrapproduzione ormonale; sono state create carpe transgeniche che portano numerose copie del gene dell'ormone della crescita delle trote e sono di un buon 20% più grosse delle carpe comuni e anche dal punto di vista nutritivo hanno le stesse caratteristiche organolettiche. A scopo sperimentale è stato ricreato un ecosistema al computer della Purdue Univesity (Indiana) e abitato da pesci della specie Oryzias latipes, comuni negli acquari e nei laboratori di ricerca; il gene dell'ormone della crescita umano, inserito nel DNA di alcuni esemplari maschi, li fa crescere più del normale rendendoli più graditi agli occhi delle potenziali compagne. Sta di fatto che gli esemplari maschi più grandi hanno anche una probabilità quattro volte superiore di accoppiarsi rispetto ai loro rivali più piccoli. In questo modo il gene che conferisce il vantaggio riproduttivo si diffonde rapidamente nelle popolazioni autoctone che verrebbero portare all'estinzione assieme a quelle transgeniche nell'arco di 40 generazioni.. Una volta raggiunta la maturità sessuale, infatti, i pesci modificati geneticamente sono meno vitali e il 30% di loro muore prima di poter sfruttare al meglio i vantaggi offerti dall'ormone della crescita umana: ovvero prima di potersi accoppiare. Uno dei traguardi più ambiti nel campo degli animali transgenici è quello di ottenere tessuti e organi animali umanizzati, da usare per i trapianti (xenotrapianti). Il principale problema è quello del rigetto iperacuto dell'organo trapiantato. Le cellule degli organi estranei presentano infatti, sulla loro superficie, degli antigeni che vengono riconosciuti dagli anticorpi naturali dell'ospite. L'interazione di questi anticorpi naturali con gli xenoinnesti induce tutta una serie di meccanismi di distruzione. Gli organi cosi trapiantati non sopravvivono per più di un'ora. L'ingegneria genetica però potrebbe risolvere questo ostacolo con la produzione di animali transgenici che esprimano nei propri organi antigeni umani, anche se vi sono notevoli risichi come ad esempio infezioni dovute alla presenza di retrovirus incorporati nel DNA degli organi trapiantati. L'animale più studiato per questo scopo è il maiale, i suoi organi infatti sono abbastanza simili a quelli umani, sia per dimensione che per funzionamento e la sua prolificità garantisce la disponibilità di individui da utilizzare a basso costo.